Розмір шрифту: 

Сьогодні на ринку ферментів переважають препарати мікробного походження, а серед них до 40% припадає на долю протеаз. Більшість з них, в основному, нейтральних і лужних, отримують з мікроорганізмів роду Bacillus. Протеази, які характеризуються наявністю групи серину в активному центрі – серинові – знайшли широке застосування у складі антимікробних та інших засобів. Тому, актуальним є питання оптимізації методів визначення активності цієї групи протеаз.

В класичному методі Вільштеттера і Вальдшмідт-Лейтц активність серинових протеаз визначається за кількістю амінного азоту, який утворюється при гідролізі розчину желатину ферментним розчином. Недоліком даного методу є неможливість автоматизувати процес, оскільки всі етапи потребують дуже кропіткої роботи, що може призвести до значних похибок. [1]

Отже, постає питання пошуку більш точних та простих методів, що дозволили б зменшити їх трудомісткість та витрати часу.

"Millipore Corporation" запропонувала метод визначення активності трипсину (серинової протеази), де за одиницю активності приймається така її  кількість, що гідролізується за 1хв у присутності іонів кальцію. Активність протеази визначають вимірюванням кількості вільних аміногруп. Перевагою  методу є доступність реактивів та технологічність виконання в лабораторії.

Іншим запропонованим прийомом є визначення кількості ферменту за вимірюванням люмінесценції реакційної суміші [2, 3]. Одним з варіантів є метод інкубації люциферази з досліджуваної пробою, після чого вимірюють біолюмінесценцію реакційної суміші, в яку попередньо вносять відновлену НАДФ-оксиредуктазу, а досліджувану пробу додають після встановлення стабільного рівня люмінесценції. Особливістю методу є застосування спектрофлуориметра та люциферази, а також необхідність додаткової графічної обробки результатів [3].

Другий метод, заснований на вимірі флуоресценції, проводиться з використанням як субстрату казеїну, міченого флуоресцентним ізотіоцианатом (FITC) [3]. Дія протеази призводить до розщеплення FITC-міченого казеїну на фрагменти, які не осідають в кислому середовищі. Отримані данні порівнюють з контролем, визначаючи активність серинової протеази. Певним недоліком методу є необхідність попередньої підготовки тіоціанату, але перевагою – точність отриманих результатів.