Наукові конференції України, Х Всеукраїнська науково-практична конференція «Біотехнологія XXI століття»

Розмір шрифту: 
СТВОРЕННЯ ТА ВІДБІР ТРАНСГЕННИХ ЛІНІЙ «БОРОДАТИХ» КОРЕНІВ CUCUMIS SATIVUS З ВИСОКИМ РІВНЕМ ЕКСПРЕСІЇ ТРАНСГЕНУ
Б.Є., М.Ю. Котик, Василенко

Остання редакція: 2015-06-24

Тези доповіді


Культури генетично трансформованих коренів використовують як модельні системи для вивчення фізіологічних та біохімічних процесів кореневих систем інтактних рослин, для дослідження симбіотичних контактів з арбускулярними мікоризними грибами. Альтернативний напрямок роботи з ризогенними культурами має прикладний характер. Він передбачає створення ефективних експресійних ліній для напрацювання рекомбінантних білків, вторинних метаболітів (алкалоїдів, флавоноїдів, глікозидів, кумаринів, фенольних сполук) та запасних речовин (інуліну, фруктанів).

З метою оцінювання можливостей кореневої культури огірка посівного як продуцента білків фармацевтичного призначення нами була отримана культура «бородатих» коренів (hairy roots) огірка посівного Cucumis sativus (сорт «Джерельний») шляхом трансформації за допомогою Agrobacterium rhizogenes. Дослідження накопичення рекомбінантного продукту в кореневій культурі проводили на прикладі репортерного зеленого флуоресцентного білку (GFP).

Матеріалом для трансформації слугували листові та стеблові експланти 19–21 денних рослин огірку, вирощених in vitro в асептичних умовах. Генетичну трансформацію здійснювали шляхом культивування експлантів з A.rhizogenes штаму А4, який містив бінарну векторну конструкцію з геном gfp під контролем 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) та геном стійкості до фосфінотрицину (bar). Після інкубації рослинного матеріалу із агробактерією протягом двох діб у темряві при температурі 22оС експланти переносили на середовище MS з додаванням 600 мг/л цефотаксиму (для елімінації бактерії) та 5 мг/л фосфінотрицину (для відбору трансформантів). В подальшому впродовж усього періоду культивування дотримувались умов: температура – 25-26оС, 16-годинний фотоперіод, освітленість 4000 лк, період субкультивування – 3 тижні. За 2 тижні після трансформації спостерігали появу перших коренів. Найбільш інтенсивний ріст «бородатих» коренів спостерігався на сегментах стеблових експлантів. Відібрані лінії трансгенних коренів культивували далі ізольовано як на твердих так і в рідких поживних середовищах, оцінюючи продуктивність культур в різних умовах вирощування. Накопичення рекомбінантного продукту (GFP) спостерігалось далеко не в усіх трансгенних лініях кореневих культур, що регенерували після трансформації. Можливість додаткового застосування під час регенерації візуальної селекції дозволило вирізняти лінії з високими рівнями експресії цільового репортерного білку серед загальної маси трансгенних коренів C.sativus. Такий підхід до відбору ліній-продуцентів може бути застосовано і в подальшому при селекції рослинних культур, що продукуватимуть білки фармацевтичного призначення.